【干货分享】小鼠胆管类器官原代建立Protocol

• 小鼠胆管类器官培养试剂盒(MA-0817H009HL/S)、基质胶(082701/082703/082755)4℃化冻；

• 小鼠胆管类器官培养基的制备：将200μL Mouse Liver Ductal Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Liver Ductal Organoid Supplement C (250x) 加至9.76mL Mouse Liver Ductal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠胆管类器官培养基，室温平衡，可在2-8°C储存，建议在两周内使用；

• 准备足量添加1%双抗的DPBS；

• 配制10mL组织消化液，现配现用，37℃摇床混匀预热，未用完消化液可-20℃保存1周（Mogengel：10mL基础液+添加物500μL)。

小鼠断脊处死，表面喷洒酒精杀菌，在无菌条件下将胆管第一大肝叶取出，用刀片切下1/2肝叶，放入4℃预冷的DPBS溶液中。

用冰冷的DPBS清洗2~3次，将组织转移到新的6cm培养皿或1.5mL EP管中，用无菌组织剪将组织剪成约0.5mm³的碎片。

将剪碎的组织转移到15mL离心管中，并加入约10mL冰冷的Basal medium。用5mL移液管上下吹打样品，以去除红血球和脂肪(它们会漂浮到溶液的顶部)。后让组织碎片沉降5~7分钟，并弃去约7.5mL的上清液，包括任何漂浮的脂肪， 后重复此洗涤步骤1~2次。

将剪碎的组织用适量的原代组织液消化液(MB-0818L06S-100)重悬，并转移至新的离心管内，于37℃，100rpm条件下的恒温振荡培养箱中，消化20-30分钟，每隔10分钟观察组织消化情况，待组织块明显分散，悬液较浑浊时，取适量组织消化悬液镜检，待悬液中有较多胆管结构即可终止消化，若组织碎块较大或消化不可适当延长消化时间。消化期间可以使用不同规格的移液器吹打组织消化悬液，帮助充分消化。 

在消化完成的组织悬液中加入胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）至终浓度达1%~5%以减缓消化作用，同时轻轻吹打5~10次。 

静置3-10min，待组织碎片自然沉降后，将上清液转移至新的15mL离心管中，剩余组织碎片中加入1mL冰冷的Basal medium吹打5~10次，静置1min待组织碎片自然沉降后，将上清收集至离心管中。在8℃下以250g的速度离心3min，弃去上清以洗去残留的消化液。若所获细胞沉淀呈红色，说明其中包含红细胞，则需在清洗前于沉淀中加入红细胞裂解液(MB-0818L08L/S)裂解红细胞，并于250g离心力离心3分钟，吸去上清液保留沉淀，再对沉淀进行清洗。

用含有抗生素的PBS或基础培养基(MB-0818L07)清洗细胞2次（混匀后250g离心力离心，3分钟，弃去上清液）以除去FBS。 

将清洗后的细胞沉淀用含有抗生素的PBS或基础培养基重悬，取少量悬液进行活细胞检测和计数，并按照100,000~500,000个细胞/mL的密度加入细胞外基质（>70%）并在冰上混匀，混匀后置于冰上。

注意：混匀吹打的动作要轻柔，切忌产生大量气泡，常温混匀则需要控制在15秒内。

用移液器吸取细胞外基质和细胞的混合液移至细胞培养孔板中，（如24孔细胞培养板每孔点20~30μL混合悬液，48孔板每孔点12.5~18μL混合悬液，96孔板孔板每孔点3~5μL混合悬液），混合悬液须点至培养孔底部中央位置，其铺开后不可接触培养孔侧壁。将培养板放入37℃，在5%CO2细胞培养箱中孵育20分钟，待细胞外基质凝固至不再流动后，沿孔壁缓缓加入培养基，(如24孔板加500μL培养基，48孔板加250μL培养基，96孔板加100μL培养基)，P0代培养3~4天换液。 

将细胞培养板放入培养箱中进行培养，每1天于倒置显微镜下观察类器官的生长状态，每3天于倒置显微镜下拍照，记录多个视野中的类器官的形态和分布。